高效液相色譜HPLC常用概念與術語主要包括：色譜圖和峰參數(shù)，定性參數(shù)，柱效參數(shù)，相平衡參數(shù)，分離參數(shù)等。

高效液相色譜HPLC常用概念與術語主要包括：色譜圖和峰參數(shù)，定性參數(shù)，柱效參數(shù)，相平衡參數(shù)，分離參數(shù)等。

一、色譜圖和峰參數(shù)

色譜圖(chromatogram)--樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。

基線(base line)--經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。

噪音(noise)--基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。

漂移(drift)--基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。

色譜峰(peak)--組分流經(jīng)檢測器時響應的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。

拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)?！吨袊幍洹芬?guī)定T應為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。

峰底-基線上峰的起點至終點的距離。

峰高(peak height，h)-峰的最高點至峰底的距離。

峰寬（peak width，W)-峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W＝4σ

半峰寬（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ

標準偏差（standard deviation，σ)-正態(tài)分布曲線x＝±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。

峰面積(peak area，A)-峰與峰底所包圍的面積。

二、定性參數(shù)（保留值）

死時間(dead time，t0)--不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。

死體積(dead volume，V0)--由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）

保留時間(retention time，tR)--從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。
保留體積(retention volume，VR)--從進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR

調(diào)整保留時間(adjusted retention time，t'R)--扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced retention time)。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0

調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，V'R)--扣除死體積后的保留體積。

三、柱效參數(shù)

理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)--用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。
N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。

用半峰寬計算理論塔數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。

N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）

若用調(diào)整保留時間(t'R)計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。

理論塔板高度(theoretical plate height，H)--每單位柱長的方差。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數(shù)計算。

四、相平衡參數(shù)

分配系數(shù)(distribution coefficient，K)--在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。

    分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學性質(zhì)有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。

    在條件(流動相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(Cs、Cm很小)時，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。

在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。

    在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質(zhì)影響。實踐中主要靠調(diào)整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。

容量因子(capacity factor，k)--化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。

    容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（t'R）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k＝0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。

    容量因子與分配系數(shù)的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關；k除了與性質(zhì)及溫度有關外，還與Vs、Vm有關。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應用更廣泛。

選擇性因子(selectivity factor，α)--相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。α又稱為相對保留時間（《美國藥典》）。

    要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質(zhì)上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。

五、分離參數(shù)

分離度(resolution，R)--相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝。當W1＝W2時，R＝。當R＝1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側峰基重疊約2%。R＝1.5時，稱為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱為完全分離。

    中國藥典規(guī)定R應大于1.5。

    提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α＝1時，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成來實現(xiàn)。k2趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在1~10范圍內(nèi)，最好為2~5，窄徑柱可更小些。

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