高效液相色譜柱由柱管與填充的固定相填料組成，常用內(nèi)壁拋光的不銹鋼管作色譜柱的柱管以獲得高柱效。柱接頭將過濾片與色譜柱管連接。

概述

高效液相色譜法是19世紀60年代末期在經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型分離分析技術(shù)，在分析速度、分離效能、檢測靈敏度和操作自動化方面取得了巨大的進步，已在生物工程、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測、石油化工等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。

高效液相色譜柱是液相色譜系統(tǒng)獲得分離的核心部件，許多分離問題都歸結(jié)于色譜柱。不同類型的色譜柱代表了不同的色譜方法。

高效液相色譜柱與經(jīng)典液相色譜柱相比，采用全多孔微粒固定相，裝填在小口徑的不銹鋼柱內(nèi)（長度大幅縮短），在高壓環(huán)境下，溶質(zhì)的擴散速度大大加快，從而在短的分析時間內(nèi)獲得高柱效和高分離能力。

高效液相色譜柱結(jié)構(gòu)及評價

高效液相色譜柱由柱管與填充的固定相填料組成，常用內(nèi)壁拋光的不銹鋼管作色譜柱的柱管以獲得高柱效。柱接頭將過濾片與色譜柱管連接，在色譜柱管的兩端要安裝過濾片，過濾片一般用多孔不銹鋼燒結(jié)材料，此燒結(jié)片上孔徑小于填料顆粒直徑，卻可讓流動相順利通過，并可阻擋流動相中的極小的機械雜質(zhì)以保護色譜柱。再用連接注螺帽、柱密封圈等將主接頭固定住。

在實際工作中，選擇性能良好的色譜柱可得到好的結(jié)果，首先要注意柱徑、長度、填料種類和填料粒度。評價一根色譜柱的主要指標是：

（1）塔板數(shù)N值

直接關(guān)系到如何更好地分離樣品，僅適用于不拖尾的對稱峰。

（2）峰不對稱性

可用不對稱因子AS測量，AS趨向于1是最好的。

（3）柱壓降

在滿足分離要求時，柱壓越低越合適。

（4）鍵合相濃度

如果濃度低表示未完全鍵合，則造成保留不能重復(fù)。

高效液相色譜柱分類

不同種類液相色譜柱的差異在于柱結(jié)構(gòu)、柱填料和柱尺寸的不同。

按色譜柱的尺寸（長度和內(nèi)徑）可分為制備型、常規(guī)分析型和微型。

按柱填料類型可分為：

（1）反相色譜柱，通常是在硅膠顆粒表面利用羥基活性鍵合烷基鏈（-C1、-C4、-C8、-C18等）或苯基（-Ph）等生成非極性鍵合固定相，以C18（ODS）使用最為廣泛。由于硅膠基質(zhì)的在堿性條件下可能造成柱床塌陷，市場上已有有機硅膠/無機硅膠混合基質(zhì)的反相色譜柱（如YMC-Triart系列反相柱）與有機聚合物基質(zhì)的反相色譜柱（如YMC Polymer C18）。

（2）正相色譜柱，通常使用球形硅膠顆粒作為填料，或為改善分離性能而硅膠顆粒表面鍵合腈基（-CN）、胺基（-NH2）、醚基（-O-）生成極性鍵合固定相。

（3）離子交換色譜柱，在硅膠或聚合物表面引入陽離子交換基團或陰離子交換基團。

（4）體積排阻色譜柱，以凝膠為填料，要依據(jù)分子尺寸大小的差異來進行分離。

（5）手性色譜柱，用于分離手性異構(gòu)體。

（6）親和色譜柱，固定相由基體、間隔臂和配位體三部分構(gòu)成。

高效液相色譜柱日常維護與保養(yǎng)

色譜柱的使用壽命，除了與所分析的樣品和流動相及使用頻率有關(guān)外，最主要的是與日常的維護密切相關(guān)。

色譜柱的使用壽命主要是根據(jù)柱效和柱壓兩個指標來衡量，如果一根色譜柱的柱效太低或柱壓太高，通常被認為該色譜柱的使用壽命已經(jīng)結(jié)束。因此，延長色譜柱使用壽命的關(guān)鍵是，消除引起柱效下降和柱壓升高的因素。以下是色譜柱的日常維護方法;

1、流動相的pH應(yīng)在色譜柱所規(guī)定使用范圍內(nèi)

流動相超過色譜柱所能承受的pH范圍將會導(dǎo)致硅膠基質(zhì)流失和鍵合相碳鏈斷裂，使柱效下降，使用壽命變短。由于流動相的pH控制不當(dāng)而對色譜柱造成的損害，通常很難使色譜柱恢復(fù)，因此必須認真對待，嚴格控制流動相的PH值

2、使用保護住和流路過濾器

樣品和流動相中含有的固體顆粒物質(zhì)會堵塞色譜柱篩板，篩板被堵不僅會引起柱壓的升高，而且也會引起柱效下降，因為篩板的堵塞會引起液流不均，導(dǎo)致色譜峰形拖尾、變寬，從而使柱效下降。保護柱和在線過濾器上都有篩板，可以阻止固體顆粒物質(zhì)到達色譜柱，防止堵塞色譜柱篩板。由于柱壓升高在分析故障中占很大比例，因此，除對樣品和流動相進行過濾外，建議在色譜柱進樣端上加上保護住和在線過濾器。

如果確認色譜柱柱壓升高是由于進樣端篩板被堵引起的，針對反相色譜柱可選擇以下方式使柱壓恢復(fù)正常：

1）先在色譜柱前加上保護住或在線過濾器，然后用甲醇/水=20/80 1.0ml/min反向沖洗色譜柱180min。

2）先在色譜柱進樣端加上保護柱或在線過濾器，然后反向使用。

3、正確使用緩沖鹽溶液

通常緩沖鹽易溶于水，難溶于有機溶劑，因此緩沖鹽使用不當(dāng)會使其析出，堵塞填料基質(zhì)的微孔和顆粒間的空隙，使填料板結(jié)，柱壓上升；同時阻礙了基質(zhì)上鍵合的碳鏈難以舒展，使色譜柱的保留能力下降，柱效降低。緩沖鹽析出后，去除非常困難，因此，正確的使用緩沖鹽對延長色譜柱使用壽命非常重要。

緩沖鹽的正確使用方法：

1）等度條件：使用緩沖鹽之前和之后都用過渡流動相以1.0ml/min流速各沖洗60min。

2）梯度條件：使用緩沖鹽前用與初始流動相組成相同的過渡流動相以1.0ml/min流速各沖洗60min,梯度設(shè)定盡量平緩，以避免梯度過程中緩沖鹽析出；

注意：過渡流動相是指有機相和水相的比例與分析流動相相同，只是過渡流動相中不含緩沖鹽。

3） 緩沖鹽溶液不能存留于色譜柱中過夜。

4）緩沖鹽析出的補救方法：

方案1：用甲醇/水=20/80以1.0ml/min流速35℃條件下反向沖洗色譜柱120min；

方案2：用甲醇/水=20/80以0.2ml/min流速反向沖洗色譜柱過夜。

4、防止強保留物質(zhì)存留在色譜柱中

強保留物質(zhì)和大分子化合物在色譜柱中累積，對樣品中的化合物產(chǎn)生額外的保留行為，不僅引起峰形變寬、拖尾，使柱效下降，同時也會引起保留時間的變化，累積到一定程度時還會導(dǎo)致柱壓升高。

由于強保留物質(zhì)和大分子化合物對色譜分離的影響是一個累積效應(yīng)，需要一定的時間才會體現(xiàn)出來，但對許多樣品特別是復(fù)雜樣品我們不知道是否含有強保留物質(zhì)，因此要防止強保留物質(zhì)的累積，需要在每一天的日常維護中，用純甲醇或乙腈清洗。

清洗方法：

1）未使用緩沖鹽：每天分析完后，用純甲醇或純乙腈反沖洗色譜柱60min。

2）使用過緩沖鹽：分析完后，先用上述方法除去緩沖鹽，然后再用純甲醇或乙腈反向沖洗色譜柱60min。

3）補救方法：用純甲醇或乙腈反向沖洗180min。

常見故障及解決方法

選擇了一根好的柱子，再加上有效的維護與預(yù)防，可以避免不少意外故障的發(fā)生。但誰也不能保證色譜柱“永遠”不出故障，任何一根色譜柱最終都會柱效柱直至報廢。損壞的標志：

①塔板數(shù)下降；

②峰形變壞；

③壓力增加；

④保留時間變化。

有時往往是幾種情況伴隨著同時發(fā)生。

1、塔板數(shù)下降

在色譜柱使用過程中，塔板數(shù)會不斷下降。一般情況下，進2000個樣品后柱效N值要降低50%（但也不能一概而論）。如果柱效下降很快或突然下降，應(yīng)考慮柱頭塌陷或進了不合格的樣品。

2、峰形變壞

出現(xiàn)峰拖尾、分叉峰或非高斯峰的原因很多，但總是與塔板數(shù)驟然下降聯(lián)系在一起的，峰形變壞而保留時間不變，多半是柱受到阻塞（不銹鋼燒結(jié)片），或者柱頭有了空穴。

3、壓力增加

和柱塔板數(shù)不斷減少一樣，在使用過程中柱壓慢慢增加，可視為正常。如果壓力很快增加過高，應(yīng)考慮兩種可能，二是樣品沉積在柱內(nèi)，而是柱內(nèi)硬件阻塞。

對于第一種情況，要用溶解所用樣品的溶劑沖洗，沖洗時拆開柱與檢測器之間接頭，以防污染檢測器流通池。如沖洗無效，應(yīng)考慮是第二種情況，先更換燒結(jié)不銹鋼過濾片。換濾片時盡量不要攪動柱頭填料，如有塌陷，可用同種填料加乙醇調(diào)成糊狀補平柱頭，壓緊，壓平，柱性能可能恢復(fù)如前。如果柱頭填料已臟，可挖去2-3mm，用新填料填平。

4、保留時間的改變

保留時間的變化有兩種類型的情況，一是同一根色譜柱樣品間的保留變化，二是不同柱之間的保留變化。對于第一種情況，在排除流動相比例和pH值的差異以及流速差異所引起的保留變化外，再確認色譜柱中是否有強保留的物質(zhì)殘留，如有殘留，請用強溶劑沖洗。第二種情況主要是由于生產(chǎn)廠家提供的色譜柱批次之間的差異所引起的，如果保留時間變化不大，可通過微調(diào)流動相或流速來解決，如果對于保留時間的再現(xiàn)性有特別要求，請在購買之前向供應(yīng)商說明，以選購質(zhì)量可靠的產(chǎn)品。

參考資料

1、色譜技術(shù)叢書，化學(xué)工業(yè)出版社

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