色譜技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱，色譜柱的一般結(jié)構(gòu)含有固定相（多孔介質(zhì)）和流動(dòng)相，根據(jù)物質(zhì)在兩相間的分配行為不同（由于親和力差異），經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），達(dá)到分離的目的。

什么是色譜技術(shù)（Chromatography）

概念：色譜技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱，色譜柱的一般結(jié)構(gòu)含有固定相（多孔介質(zhì)）和流動(dòng)相，根據(jù)物質(zhì)在兩相間的分配行為不同（由于親和力差異），經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），達(dá)到分離的目的。

簡單的說，色譜技術(shù)是在特定的色譜柱當(dāng)中，利用不同物質(zhì)與固定相的親和力差異而實(shí)現(xiàn)分離的一組技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是分辨率高，是生化產(chǎn)品純化、分析的重要手段，這一切均源于其特殊的分離模式，即塔板理論

色譜分離方法的分類

色譜分離方法很多，種類有四、五十種。但常用于生物大分子分離的色譜方法，按機(jī)理分，有以下幾種：

1、吸附色譜

2、分配色譜

3、離子交換色譜

4、凝膠色譜

色譜分離的基本概念

1、分配系數(shù)：可由Langmuir方程得出

K_d=q/c

K_d---分配系數(shù)

q、c---溶質(zhì)在固相和液相中的濃度

2、保留時(shí)間（t_R）和保留體積（V_R）：反應(yīng)樣品在柱子中的保留或阻滯能力，是色譜過程的基本熱力學(xué)參數(shù)之一

3、色譜柱的理論塔板數(shù)、塔板高度

反應(yīng)不同時(shí)刻溶質(zhì)在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關(guān)系

理論塔板數(shù)的計(jì)算方法：

N---理論塔板數(shù)   t_R---保留時(shí)間

W_1/2---半峰寬    W_b---峰底寬度

理論塔板高度：

L---柱長

吸附色譜

1、原理：利用溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力(范德華力，包括色散力、誘導(dǎo)力、定向力以及氫鍵)的差異而實(shí)現(xiàn)分離

2、關(guān)鍵要素：吸附劑（固定相）和展開劑（流動(dòng)相）的選擇

3、吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺等，均含有不飽和的氧原子或氮原子以及能夠形成氫鍵的基團(tuán)，如-OH和-NH₂

4、常用的吸附劑：

氧化鋁、硅膠、活性炭、纖維素、聚酰胺、硅藻土

5、展開劑的選擇

展開劑極性越大，對同一化合物的洗脫能力越大

因此，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整展開劑的極性以獲得最佳的分離的效果

展開劑選擇的原則：

（1）對被分離組分應(yīng)具有一定的解吸附能力，極性應(yīng)比被分離物質(zhì)的極性略小

（2）展開劑應(yīng)對被分離物質(zhì)具有一定的溶解能力

6、吸附色譜的操作程序

（1）根據(jù)要分離組分的性質(zhì)（包括極性、分子量、分子結(jié)構(gòu)）選擇合適的固定相和流動(dòng)相

（2）吸附操作：選擇合適的操作條件（溫度、pH值、流速），進(jìn)行裝柱、平衡、上樣，測定穿透樣品含量以調(diào)整操作參數(shù)

（3）洗脫：采用有機(jī)溶劑洗滌、調(diào)節(jié)pH值以及體系離子強(qiáng)度，最大限度地回收目標(biāo)產(chǎn)物

分配色譜

1、原理：利用溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同而分離的方法

2、構(gòu)成要素：固定相、載體、流動(dòng)相

載體：通常為惰性材料，能吸附固定相液體

載體種類：

硅膠、硅藻土、纖維素、葡聚糖凝膠

固定相：通常選取各組分溶解度大的溶劑作為固定相

流動(dòng)相可以是極性的（反相色譜法），也可以是非極性的（正相色譜）

*反相色譜固定相是非極性的流動(dòng)相是極性的

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