發(fā)布時(shí)間: 2014-04-23 人氣指數(shù): 4199
在日常分離分析工作中,液相色譜柱的使用和維護(hù)十分重要,色譜柱使用是否得當(dāng),直接影響色譜柱的壽命,稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中,需要注意下列問(wèn)題,以維護(hù)色譜柱。
日常分離分析工作中,液相色譜柱的使用和維護(hù)十分重要,液相色譜柱使用是否得當(dāng),直接影響柱子的壽命,稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。
液相色譜柱的正確使用:
(1)柱子在裝卸、更換時(shí),動(dòng)作要輕,接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng),以免柱床產(chǎn)生空隙。
(2)如果儀器用來(lái)做常規(guī)分析,樣品種類有限,但分析次數(shù)多,則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱,這樣有助于延長(zhǎng)柱子的壽命。
(3)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩。
(4)應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?,反之亦然?/p>
(5)如使用柱溫控制裝置時(shí),應(yīng)注意在通人流動(dòng)相后才能升溫。
(6)一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖,只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
(7)選擇使用適宜的流動(dòng)相,以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一個(gè)預(yù)柱,分析柱是鍵合硅膠時(shí),預(yù)柱為硅膠,可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”,避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
(8)避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi),需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個(gè)保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
(9)經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱,清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí),對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡,每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,即常規(guī)分析需要50-75mL。
(10)保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
(11)色譜柱使用過(guò)程中,如果壓力升高,一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)人柱內(nèi),使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,死體積增大。
(12)在完成分離分析工作之后,不應(yīng)立即停機(jī),需及時(shí)對(duì)色譜分析系統(tǒng)進(jìn)行沖洗,一般0.5h以上,以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。
液相色譜柱的維護(hù):
一、色譜柱的平衡
反相色譜柱由工廠測(cè)試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請(qǐng)一定確保您分析樣品所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。
每天用足夠的時(shí)間以流動(dòng)相來(lái)平衡色譜柱,您就會(huì)在處理問(wèn)題方面獲得最大的"補(bǔ)償",而且您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長(zhǎng)!操作步驟:
a.平衡開(kāi)始時(shí)將流速緩慢地提高,用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線(緩沖鹽或離子對(duì)試劑流速如果較低,則需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡)
b.如果使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽,應(yīng)注意用純水"過(guò)渡"即每天分析開(kāi)始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動(dòng)相平衡;分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護(hù)柱子。
二、色譜柱的再生
長(zhǎng)期使用的色譜柱,往往柱效會(huì)下降(柱子的理論塔板數(shù)減低)。可以對(duì)色譜柱進(jìn)行再生,在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵進(jìn)行柱子的再生。
建議用來(lái)沖洗柱子的溶劑體積
色譜柱尺寸 柱體積 所用溶劑的體積
125-4mm 1.6ml 30ml
250-4 mm 3.2ml 60ml
250-10mm 20ml 400ml
選擇再生方法:
極性固定相(如Si,NH2* ,DIOL基色譜填料)的再生:正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非極性固定相(如反相色譜填料RP-18,RP-8,CN等)的再生: 水→乙腈→氯仿(或異丙醇)→乙腈→水
注意:
a. 在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí),由于NH2可能以銨根離子的形式存在,因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗,然后再用水沖洗至堿溶液完全流出
b. 0.05M稀硫酸可以用來(lái)清洗已污染的色譜柱,如果簡(jiǎn)單的用有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì),在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
三、色譜柱的維護(hù)
a.使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度)
b.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5,盡量不超過(guò)該色譜柱的pH范圍
c.避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化
d.流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過(guò)濾處理
e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相,應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈,并保存于甲醇或乙腈中
f.氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性,故使用時(shí)要注意,柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類溶劑,以避免腐蝕。
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